產(chǎn)品中心
PRODUCT CENTER
糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒（I）
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貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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FD106 |
BcMag? 糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒（I） |
一個(gè) |
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存儲(chǔ)條件 |
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2.5μm BcMag?酰肼基磁珠 |
4℃ |
150mg |
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10x結(jié)合緩沖器 |
4℃ |
10ml |
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氧化劑（NaIO4） |
4℃ |
100mg |
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5 x洗滌緩沖液 |
4℃ |
15ml |
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10xPBS |
4℃ |
5.0ml |
儲(chǔ)存：收到產(chǎn)品時(shí)，將試劑盒儲(chǔ)存在4oC。
在自然的條件下，大多數(shù)生物化合物不含羰基酮或醛。然而，蛋白質(zhì)上其他類似的基團(tuán)也可能有效地形成固定位點(diǎn)，該固定位點(diǎn)可以共價(jià)偶聯(lián)目標(biāo)物質(zhì)。并且遠(yuǎn)離活性中心或結(jié)合區(qū)。糖復(fù)合物，如糖蛋白和糖脂，通常在相鄰碳原子上含有具有羥基的糖殘基。用高碘酸鈉氧化這些順式二醇就會(huì)產(chǎn)生可用作共價(jià)固定位點(diǎn)的醛基。
BcMag ? 糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒使用酰肼基活化磁珠和特定催化劑，與糖蛋白和抗體產(chǎn)生親和反應(yīng)，這些糖蛋白和抗體的Fc部分通常有大量碳水化合物（糖基化）。本試劑盒通過(guò)氧化的碳水化合物基團(tuán)，來(lái)固定糖基化蛋白（包括單克隆抗體），以產(chǎn)生可重復(fù)使用的親和基質(zhì)。這種使用酰肼基團(tuán)化學(xué)固定的抗體，具有抗原結(jié)合位不會(huì)受到阻礙的有點(diǎn)，和對(duì)抗體具有優(yōu)良的純化能力。在含有催化劑的，簡(jiǎn)單的非胺緩沖液中，完全偶聯(lián)只需要2至4小時(shí)?？贵w和常見(jiàn)糖蛋白的偶聯(lián)效率通常大于85%，每毫克的酰肼基磁珠可以固定15μg至20μg蛋白。用穩(wěn)定的糖蛋白或抗體制備的基質(zhì)可以再生并重復(fù)使用至少五次，而不會(huì)明顯喪失結(jié)合能力。
BcMag ? 酰肼基磁珠是在表面連接有高密度酰肼官能團(tuán)的均勻磁珠。酰肼基磁珠可通過(guò)糖基化位點(diǎn)可有效的對(duì)糖蛋白進(jìn)行標(biāo)記、固定或偶聯(lián)；這些位點(diǎn)通常（與大多數(shù)多克隆抗體一樣）遠(yuǎn)離關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)部位，這樣就完美的保留了這些關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的功能。以這種選擇性地與靶向分子Fc部分的重鏈結(jié)合的方式偶聯(lián)抗體，有助于Fv區(qū)域末端盡可能最好地保存抗原結(jié)合活性。在pH 5至7條件下，酰肼基的載體和化合物將與氧化碳水化合物的羰基結(jié)合，從而產(chǎn)生腙鍵（圖1）。酰肼基磁珠結(jié)合較大的糖蛋白和糖脂，碳水化合物或其他配體。它的親水性表面基團(tuán)保證了磁珠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，具有極低的非特異性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各種緩沖液中處理。
工作流程
本款磁珠可以完美地作為親和樹(shù)脂進(jìn)行親和純化，將分子、細(xì)胞和部分細(xì)胞提取物進(jìn)行提煉純化。在與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標(biāo)分子的樣品中，然后混合、孵育、洗滌和洗脫目標(biāo)分子。
功能和優(yōu)點(diǎn)。
· 特異性的固定反應(yīng)------酰肼基活化磁珠僅會(huì)與，已被高碘酸鹽（例如唾液酸）輕度氧化的，含有糖基的純糖蛋白結(jié)合。
· 穩(wěn)定的共價(jià)鍵，低水平的配體泄漏
· 維持抗體功能-----通過(guò)Fc區(qū)固定IgG，保留兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，均可用于靶目標(biāo)的捕獲。
· 極低的非特異性結(jié)合率
· 極高的固定容量：15-20μg抗體/mg磁珠。
操作協(xié)議
提示
l 強(qiáng)烈建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行滴定優(yōu)化，以確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相應(yīng)地放大和縮小。
l 應(yīng)避免使用含有伯胺基團(tuán)或糖類的Tris或其他緩沖液，因?yàn)樗鼈儠?huì)與預(yù)期的
偶聯(lián)反應(yīng)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠。
所需耗材
1.磁力分離器（適用于手動(dòng)操作）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號(hào)的磁力分離器：
BcMag? separator-2可以容納兩個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);
BcMag? separator-6可以容納六個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);
BcMag? separator-24可以容納24個(gè)單獨(dú)的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);
BcMag? separator-50可以容納一個(gè)單獨(dú)的50 ml離心管，一個(gè)15ml的離心管，以及四個(gè)1.5ml離心管(Cat.# MS-04);
BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).
2.Coupling Buffer: 0.1 M 磷酸鈉, pH 7.0
3.氧化劑: Sodium meta-Periodate (NaIO4) (Sigma, Cat# S1878)
4.Washing Buffer: 1M NaCl
5.PBS
6. 2.5 μm BcMag? 酰肼基磁珠
配體的偶聯(lián)反應(yīng)
A. 磁珠的準(zhǔn)備
1.稱取30 mg磁珠，并將其加入到1.5 ml離心管中。
2.加入1毫升coupling buffer，并通過(guò)渦旋或移液器吹吸方式將磁珠充分懸浮。
3.將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。
4.將清洗的磁珠準(zhǔn)備進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。
B.糖蛋白或其他配體的氧化
注意：該反應(yīng)對(duì)光敏感，應(yīng)在黑暗中進(jìn)行。
1.將0.5-10 mg糖蛋白或者其他配體溶解或稀釋于1 ml Coupling Buffer中。（注：如果蛋白質(zhì)或者其他配體已經(jīng)懸浮在其他緩沖液中，則通過(guò)透析脫鹽柱進(jìn)行緩沖液交換。）
2.將蛋白質(zhì)其他配體溶液添加到含有2 mg高碘酸鈉（最終濃度為10 mM）的棕色小瓶中。輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解氧化劑。
3.在室溫下，將樣品在黑暗中緩慢旋轉(zhuǎn)孵育45分鐘。
C.偶聯(lián)反應(yīng)
1. 將氧化后的蛋白質(zhì)或其他配體溶液添加到步驟A4制備的磁珠中，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)或移液器吹吸方式充分混合。
提示：偶聯(lián)效率取決于目標(biāo)糖蛋白或其他配體的結(jié)構(gòu)和大小。用戶應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化蛋白質(zhì)與磁珠的比例。
2. 在室溫下，在黑暗中孵育反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)程中保持充分混合
3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。取下試管，用5ml的Coupling buffer通過(guò)渦懸或者吹吸重新懸浮磁珠。
4. 重復(fù)步驟3三次。
5. 用含有0.1%疊氮化物（w/v）的PBS緩沖液重新懸浮磁珠至所需濃度，在4°C下儲(chǔ)存，直至使用。不要冷凍保存。
D、常見(jiàn)親和純化過(guò)程
提示：
l 該方案是一個(gè)通用的親和純化發(fā)法。因?yàn)闆](méi)有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計(jì)一個(gè)通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個(gè)用戶必須確定純化單個(gè)目標(biāo)蛋白的最佳工作條件。
l 強(qiáng)烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)行滴定，以優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中使用的磁珠數(shù)量。使用過(guò)多的磁珠
將導(dǎo)致較高的背景，而使用過(guò)少的磁珠將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通?？膳c10-20μg靶蛋白結(jié)合。
1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。
2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過(guò)震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30
秒。將試管至于室溫環(huán)境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。
3.重復(fù)步驟2 兩次。
4. 向含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過(guò)的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小時(shí)（溫度越低，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)）。
提示：強(qiáng)烈建議進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間。因?yàn)榉趸臅r(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致很高的背景。
5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。
提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會(huì)降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20。
6. 通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒?，如?/span>pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標(biāo)蛋白。
