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蛋白 A磁珠

運輸條件: 常溫運輸

儲存條件: 收到后，根據(jù)試劑盒要求儲存.

簡介 

BcMag? Protein A Magnetic Beads 是大容量、高通量的親和磁珠，用于抗體純化和免疫沉淀實驗，可使用手動或全自動儀器操作。這種磁性微球表面共價固定了高密度，超純（純度>97%）的重組蛋白A。蛋白A磁珠用于從血清、細胞培養(yǎng)上清液或腹水中純化抗體，以及從細胞或組織提取物中純化抗原IP/Co IP。我們對蛋白A磁珠的操作步驟進行了改進，使目標抗體或抗原的回收率和純度達到最大。對于純化抗體，將磁珠與抗體溶液一起孵育，磁珠通過磁力從上清液中分離。對于免疫沉淀反應，將鏈接有抗體的磁珠加入到含有抗原的樣本中，并進行孵化以形成抗體-抗原復合物。使用洗脫緩沖液將附著的抗體或抗原從磁珠上分離，并使用磁力分離器手動從溶液中回收或使用自動化儀器回收。

A蛋白是一種結合在細胞壁上的蛋白抗體，來源于金黃色葡萄球菌。它包括一條含有很少或沒有碳水化合物的多肽鏈，其分子量為42kDa。它由一個信號序列、五個串聯(lián)排列的免疫球蛋白結合結構域E-D-a-B-C組成，每個結合結構域可以與來自各種哺乳動物IgG蛋白  H2-CH3的重鏈恒定區(qū)（Fc）和一個細胞壁結合結構域強力結合。重組蛋白A比天然蛋白A具有更高的結合容量和更優(yōu)良的特異性IgG結合效率，因為它只保留了與IgG結合的結構域。蛋白質(zhì)A可以與來自各種動物的抗體結合，包括小鼠、人類、兔子、豬、狗和貓。表1列出了抗體結合特性。

特點及優(yōu)勢

· 適用于快捷，簡便的一步高通量程序---無需純化柱或過濾器，或者重復的移液或離心

· 高效----與其他同類型磁珠相比，表面連接有更多的IP靶抗原。

· 極低的非特異性結合---穩(wěn)定的預活化磁珠，提供高純度的純化結果

· 結果一致性-----與僅依靠離心的經(jīng)典IP方法相比，磁珠減少了材料損失，并提供了更有效的分離結果。

· 磁珠用途廣泛，既可用于人工操作，也可用于自動化操作。

應用

· 免疫沉淀，包括IP, Co-IP, ChiP, RIP

· 細胞分選

· 抗體的高通量篩選和純化

使用說明

抗體純化

使用蛋白A磁珠從血清中純化抗體為例，一般純化方案如下(Fig.1):

Protocol

1. Materials Required

緩沖液成分

l BcMag?.Protein A Beads (懸浮在10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.1% BSA,1 mM EDTA, pH7.4, 0.1% NaN3緩沖液中)

l 1x Protein A Binding/Washing Buffer (57.7 mM Na2HPO4,42.3 mM NaH2PO4, pH 7.0)

l 1x Protein A Elution Buffer (0.2 M Glycine/HCl,pH 2.5)

l 1x Protein A Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)

所需耗材

l 磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號的磁力分離器：

BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05)；對于大體積生物樣品純化，可選用陶瓷磁體塊分離器（6英寸x 4英寸x 1英寸氧化鐵磁體塊，應用磁體，Cat# CERAMIC-B8）。

l Corning 430825 細胞培養(yǎng)瓶適用于大規(guī)模純化(Cole-Parmer,  Cat#EW-01936-22)

l Mini  BlotBoy 3D搖床，定速型，小型10x 7.5平臺，帶平墊（Benchmark Scientific, Inc. Cat# B3D1008）或類似型號

操作過程

提示：

l 該方案是經(jīng)過優(yōu)化的，可用于純化來自不同來源的大多數(shù)IgG抗體。然而，由于沒有兩種抗體完全相同，因此不可能為所有IgG純化設計一個通用試劑盒。為了獲得最佳結果，每個用戶必須根據(jù)故障排除部分中的建議，確定純化單個抗體時的最佳工作條件，尤其是弱結合抗體（見表1）。

l 為確保離子強度和pH值的最佳結合條件，有必要在純化前用Binding/ Washing buffer按照至少1:1比例稀釋血清樣品、腹水或組織培養(yǎng)物。通過離心或0.2μm過濾器過濾，去除樣品中的任何不溶性物質(zhì)。

l 在純化IgG之前，用戶應將試劑盒中包含的所有試劑平衡至室溫，并通過用4倍體積雙蒸餾水稀釋5x stock solutions制成1x working solutions。

A.  磁珠預處理

1. 輕輕搖動裝有BcMag ?蛋白質(zhì)A磁珠的瓶子，直到磁珠完全懸浮。將適量的磁珠轉(zhuǎn)移到新的試管中。

提示：

l 每個用戶應根據(jù)粗樣品中的IgG量，根據(jù)經(jīng)驗確定使用的最佳磁珠量。過多的磁珠會導致很高的背景;太少會降低蛋白產(chǎn)量。我們建議每100μg IgG抗體添加100μl完全懸浮的磁珠。通常，高效價兔抗血清的IgG含量約為5mg/ml，小鼠腹水的IgG含量約為10mg/ml，山羊或綿羊抗血清的IgG含量約為20mg/ml。

l 在分液之前，不要讓懸浮的磁珠放置超過5分鐘。每隔3分鐘對磁珠進行一次混勻。

2. 將試管放在磁力分離器上1分鐘。當試管留在磁力分離器上，上清液完全澄清時，去除上清液。將試管從分離器上取下，并使用5倍體積的1x Binding/Washing Buffer通過漩渦清洗磁珠。再將試管放在磁力分離器上1分鐘。當試管留在磁力分離器上，上清液完全澄清時，去除上清液。

3. 重復步驟 (2)一次. 清洗過的磁珠即可用于純化實驗.

B.   純化

1. 向樣品中加入等體積的1x Binding/Washing Buffer并充分混合。

2. 將清洗好的磁珠[步驟A（3）]混合到樣品中，并在室溫下，使用Mini BlotBoy 3D Rocker連續(xù)旋轉(zhuǎn)孵育5-10分鐘或在4oC下孵育30-45分鐘。

3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當試管留在磁力分離器上，上清液完全澄清時，去除上清液。將試管從分離器上取下，并使用10倍體積的1x Binding/Washing Buffer通過顛倒混勻10次清洗磁珠。再將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當試管留在磁力分離器上，上清液完全澄清時，去除上清液。

4. 重復步驟(3) 六次.

提示：

l 這一步驟對于獲得高純度蛋白質(zhì)至關重要。對于某些蛋白質(zhì)來說，可能需要清洗磁珠六次以上，以減少非特異性結合。

l 在結合/洗滌緩沖液中加入非離子洗滌劑（0.5%Triton X 100，0.5%Tween 20），也可以減少非特異性結合。

5.  加入適量的Elution Buffer，通過上下移液10-12次或渦旋混勻攪拌5分鐘。

6.  收集含有抗體的上清液并將其轉(zhuǎn)移到新的試管中。并立即加入1/10體積的neutralization buffer并充分混合，中和洗脫的抗體溶液。

問題及解答:

1. 有時候，為什么I gG不能從磁珠中洗脫？

l 洗脫緩沖液的pH值可能不正確。正確的pH值應為2.5。

l 洗脫條件太溫和，無法洗脫抗體

l 因為一些抗體只能在pH值為2.0時洗脫。

2. 免疫反應洗脫抗體的丟失或產(chǎn)量低的原因是什么？

一旦洗脫緩沖液通過添加中和緩沖液立即中和，它將不會影響大多數(shù)抗體的免疫反應性。然而，一些抗體（例如，一些單克隆抗體）不耐酸，并且在非常低的pH值下會不可逆轉(zhuǎn)地失去活性。對于那些對低pH敏感的抗體，一步法抗體純化試劑盒是傳統(tǒng)抗體純化的替代方法。該試劑盒是一種快速、一步法、可有效的從血清和其他樣本類型中分離抗體的方法。磁珠結合并去除血清蛋白，從而在上清液中收集到純IgG（圖2）。由于不涉及苛刻的洗脫條件，抗體活性可100%保存。    

3. 為什么在抗體洗脫溶液中觀察到多條帶？

某些宿主蛋白可能與目標抗體發(fā)生非特異性相互作用。用戶可在結合和洗脫緩沖液中添加NaCl（50-200mM，最終濃度）。

免疫沉淀方案

A.所需額外材料

?1.5mL微量離心管

?用于免疫沉淀的抗體

?抗原樣品

?裂解緩沖液：20 mM Tris-HCl pH 8，137 mM NaCl，1%Nonidet P-40（NP-40），2 mM EDTA。可在4℃條件下儲存6個月。使用前立即添加蛋白酶抑制劑。

?清洗緩沖液：10mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA，1mM EGTA；pH 8.0，0.5 M NaCl，1% Triton X-100，0.05%吐溫-20 0.2 M原釩酸鈉，蛋白酶抑制劑混合物。在4°C條件下儲存6個月。使用前立即添加蛋白酶抑制劑。0.05%吐溫-20去垢劑和0.5M  NaCl

?洗脫緩沖液（0.2 M甘氨酸/HCl，pH 2.5）

?中和緩沖液（1.0 M Tris-HCl，pH 9.0）

A. 磁力分離器

l 磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號的磁力分離器：

BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05)；

B. 免疫沉淀操作

提示：本方案是免疫沉淀的一個例子，使用者需要對每種不同應用進行優(yōu)化。

1.樣品制備

a. 粘附細胞

a） 將細胞培養(yǎng)皿或燒瓶置于冰上，清除培養(yǎng)基，并用冷藏過的PBS緩沖液清洗細胞。

b）清除PBS緩沖液，然后加入適當體積的冷藏的裂解緩沖液（每1毫升含有10⁷個細胞/100 mm²培養(yǎng)皿/150 cm²燒瓶；或每0.5毫升含有5x10⁶個細胞/60 mm²培養(yǎng)皿或75 cm²燒瓶）

注：優(yōu)化裂解緩沖液的體積是必要的，以確保完全裂解細胞和確定最終裂解產(chǎn)物中最佳的蛋白質(zhì)濃度。

c） 在冰上孵育20分鐘，然后用細胞刮刀將粘附細胞從培養(yǎng)皿或燒瓶中刮下，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，并在4℃下，以13000rpm離心10分鐘以收集裂解上清液。

d） 將上清液（避開沉淀）收集到一個新的微量離心管中。通過適當?shù)姆椒y定蛋白質(zhì)濃度。

e） 繼續(xù)進行免疫沉淀或在-20°C或-80°C下儲存，直到需要為止。

b. 懸浮細胞

a） 將細胞轉(zhuǎn)移到錐形管中。

b） 在室溫下以1400rpm 的低速離心5分鐘，使細胞沉淀，并吸出培養(yǎng)基。

c） 用10ml 冷藏的PBS緩沖液洗滌細胞。

d） 以低速（1400 rpm）離心細胞，去除PBS清洗緩沖液。

e） 重復清洗步驟。

f） 加入適當體積的冷藏的裂解緩沖液（每2 x 10⁶個細胞加入10ul至100μl），并在冰上孵育細胞30min。

提示：如有必要，將裂解物在冰上超聲處理20-30秒，以破壞基因組DNA和細胞成分。

g） 在4oC下以13000rpm離心10min

h） 將上清液收集到新的試管中，并通過適當?shù)姆椒y定蛋白質(zhì)濃度。用裂解緩沖液將濃度調(diào)節(jié)至2.5 mg/ml。

i） 繼續(xù)進行免疫沉淀或在-20°C或-80°C下儲存，直到需要為止。

c. 組織細胞的裂解

a） 將生物組織切成小塊，用冷藏的PBS清洗兩次。

b） 將約5 mg切碎的組織轉(zhuǎn)移到試管中，并加入300μl冷藏的裂解緩沖液。用電動均化器進行均化或在冰上進行超聲處理。

c） 在4℃下，以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min。

d） 將上清液收集到新的試管中。通過適當?shù)姆椒y定蛋白質(zhì)濃度。

e） 繼續(xù)進行免疫沉淀或在-20℃或-80℃下儲存，直到需要為止。 

2.   將100-150μg細胞裂解物與適量抗體在1.5mL離心管中混勻，并用細胞裂解緩沖液將反應體積調(diào)至400-500μL。在室溫下孵育反應1-2小時，或在4oC下連續(xù)旋轉(zhuǎn)過夜。

提示：優(yōu)化每次應用所用抗體的數(shù)量是必要的。過量的抗體會導致較高的背景值?？贵w不足會導致結合效率下降。需要進行中試實驗來確定，與目標蛋白質(zhì)結合的抗體的最佳加入比例。通常在這類實驗當中，通過增加抗體的加入量，來確定固定量目標蛋白質(zhì)最佳的抗體加入濃度。以下是抗體使用的一般操作說明。對于單個抗體，請查看抗體說明書中推薦的抗體濃度。

對于100–150μg細胞裂解物，使用：

?1-5μL多克隆抗血清

?1μg親和純化的多克隆抗體

?0.2–1μL腹水（單克隆抗體）

?20–100μL細胞培養(yǎng)上清液（單克隆抗體）

3.將適量BcMag?蛋白G磁珠放入到1.5mL的離心管中。

提示：

?使用前震蕩試劑瓶，直到磁珠變得均勻。

?使用的磁珠量通常由磁珠的抗體結合能力（約60μg IgG/mg）和所用抗體類型來確定。

?在吸取磁珠溶液前，不要讓磁珠靜置超過5分鐘。每隔3分鐘對磁珠進行一次混勻。

4.用1ml清洗緩沖液清洗磁珠，輕輕渦旋混合。用磁力分離器收集磁珠，并清除上清液。

5.將抗原樣品/抗體混合物加入到預先清洗過的磁珠中，并在室溫下連續(xù)旋轉(zhuǎn)孵育1小時。

6.用磁力分離器收集磁珠，取出上清液，并保存起來進行分析。

7.加入500μL清洗緩沖液，通過移液器吹吸混勻10次，清洗磁珠。收集磁珠并清除上清液。

8.重復清洗兩次，直到上清液在280nm處的吸光度接近背景水平（OD280<0.05）。

提示：向清洗緩沖液中添加高濃度的鹽、非離子去垢劑和還原劑可以減少非特異性背景值。例如，我們向清洗緩沖液中添加NaCl（高達1-1.5M）、0.1-0.5%的非離子去垢劑（如Triton X 100或Tween 20）和還原試劑如DTT或TCEP（通常為3mM）。

9.向試管中加入500μL超純水，輕輕混合。在磁力分離器收集磁珠并去掉上清液。

10.加入10-100μL洗脫緩沖液，用移液器上下吹吸10-20次。將上清液收集到新試管中。添加的1/10體積的中和緩沖液。

問題解答.